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IVIM-PM2.5在呼吸系統(tǒng)中的暴露誘導(dǎo)不同的 肺部和小鼠肝臟的炎癥信號(hào)

  • 2021年8月17日 YangJinZhu來(lái)源:互聯(lián)網(wǎng) 976 61
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呼吸系統(tǒng)暴露在PM2.5中會(huì)誘導(dǎo)出小鼠肺和肝臟不同的炎癥信號(hào)

  細(xì)顆粒物質(zhì)2.5(PM2.5)是目前威脅公共衛(wèi)生的有害空氣污染物。雖然已經(jīng)對(duì)小鼠和人類的PM2.5的一般負(fù)面影響進(jìn)行了許多研究,但各種免疫細(xì)胞的遷移模式響應(yīng)PM2.5暴露仍然尚不清楚。在這項(xiàng)研究中,我們旨在探討肺部的免疫細(xì)胞遷移反應(yīng)和腹腔內(nèi)PM2.5接種小鼠的肝臟。為了研究肺部免疫細(xì)胞和小鼠肝組織中的免疫細(xì)胞遷移軌跡,我們使用微觀工具,包括雙光子倒注成像,組織學(xué)分析和透射電子顯微鏡。

  我們來(lái)自兩光膜內(nèi)腔內(nèi)成像的數(shù)據(jù)表明,與非處理的條件相比,肺部肺和PM2.5處理小鼠的肝臟滲透中性粒細(xì)胞的數(shù)量沒(méi)有顯著差異。然而,從組織學(xué)分析和透射電子顯微鏡從血管灌注后去除血管內(nèi)白細(xì)胞,我們觀察到在肺部和PM2.5處理的小鼠的肺部經(jīng)常觀察到一些白細(xì)胞。有趣的是,使用流式細(xì)胞術(shù)的白細(xì)胞群定量顯示出肺中的中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的顯著增加,但在PM2.5后24小時(shí)的肝臟中沒(méi)有太多。

  這些數(shù)據(jù)意味著肺和肝臟的雙光子倒注成像實(shí)際上可視化中性粒細(xì)胞,其粘附在脈管系統(tǒng)的腔側(cè)。然后我們進(jìn)行mRNA微陣列分析以進(jìn)一步觀察PM2.5如何影響肺部和肝臟中的基因表達(dá)模式。PM2.5治療改變了與肺中IL-17信號(hào)傳導(dǎo)途徑相關(guān)的mRNA表達(dá),并改變了與肝臟中代謝途徑相關(guān)的mRNA表達(dá)??傊@些結(jié)果表明肺部的免疫應(yīng)答在急性PM2.5誘導(dǎo)的炎癥下的肝臟中的顯著調(diào)節(jié),因此這些器官通過(guò)不同的信號(hào)通路調(diào)節(jié)。

  Introduction

  近年來(lái),顆粒物 (PM2.5) 因其生物危害效應(yīng)而成為世界范圍內(nèi)各種人工污染物中的關(guān)注焦點(diǎn)。與自然產(chǎn)生的“灰塵”不同,PM 主要由柴油燃燒、建筑工廠和發(fā)電廠排放的化學(xué)物質(zhì)組成[1]。PM根據(jù)大小可分為兩組:PM10和PM2.5。PM10 是指直徑小于 10 μm 的顆粒物,而 PM2.5 是指直徑小于 2.5 μm 的顆粒物。雖然 PM 的成分因來(lái)源而異,如重金屬和酸性物質(zhì),但主要由黑碳組成。PM可以吸入氣管和肺部,因?yàn)樗鼧O小且易于沉積到肺泡甚至是血液中,會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。因此,這種炎癥可能不僅是導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)障礙的原因,也可能引發(fā)各種器官的永久性損害。暴露于PM2.5中也會(huì)導(dǎo)致生殖能力變差[2]和或腦功能損傷[3]。

  肺是管理血液中氧氣和二氧化碳交換的重要器官。由于肺部與空氣直接接觸,這個(gè)器官不可避免地面對(duì)許多病原體,從灰塵到病毒。當(dāng)氣管和肺組織暴露于人造污染物時(shí),白細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子,導(dǎo)致急性炎癥[4],PM可以誘導(dǎo)并加強(qiáng)這些信號(hào)分子的分泌。因此,PM 會(huì)影響肺部通路并加重慢性阻塞性肺病[5,6]、肺炎 [7] 和哮喘[8]等疾病。關(guān)于PM2.5對(duì)肺部的影響已經(jīng)研究了幾十年,但對(duì)肝臟影響的研究報(bào)告是相當(dāng)罕見(jiàn)的。肝臟在身體中有解毒功能并凈化血液[9,10]。然而,因?yàn)楦闻K被稱為沉默器官,當(dāng)個(gè)體暴露于PM2.5時(shí),難以檢測(cè)炎癥的癥狀。然而,由于肝臟被稱為“沉默的器官”,當(dāng)個(gè)體暴露于 PM2.5環(huán)境中,很難發(fā)現(xiàn)炎癥癥狀。在這里,我們檢查了PM暴露小鼠模型中 PM2.5 是否通過(guò)引起炎癥來(lái)影響肺和肝臟。此外,還進(jìn)行了微陣列分析以研究肺和肝臟的信號(hào)通路。

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  圖 1:暴露于顆粒物 2.5 的小鼠肺和肝臟中性粒細(xì)胞的雙光子活體成像。(a) 圖片展示 超聲處理前后 PM2.5 的差異。比例尺,10μm。用 PM2.5 處理 LysM-GFP 小鼠, 分別通過(guò)小鼠肺 (b) 和肝臟 (c) 的雙光子活體成像在治療后 24 小時(shí)和 48 小時(shí)記錄中性粒細(xì)胞???視頻 1、2、3 和 4。血管被葡聚糖-德克薩斯紅染色。比例尺,50μm。10 分鐘時(shí)的中性粒細(xì)胞數(shù)為 分別從小鼠肺(d)和肝臟(e)的雙光子成像計(jì)數(shù)。中性粒細(xì)胞沒(méi)有明顯增加 與對(duì)照組相比,肺和肝組織中的數(shù)量。

  Discussion

  由于PM2.5粒徑極小,幾乎可以通過(guò)血液到達(dá)身體的所有器官[22]。據(jù)報(bào)道,空氣中高濃度的 PM2.5 會(huì)導(dǎo)致心臟和呼吸系統(tǒng)疾病的增加 [12]。肺是可以通過(guò)氣管直接吸入PM2.5的器官,而肝臟不與PM2.5直接接觸。選擇肝臟作為比較器官來(lái)研究吸入的 PM2.5 對(duì)肺的影響,因?yàn)樗趽p傷的早期階段起到解毒的作用,并且無(wú)癥狀[13]。我們對(duì)這兩個(gè)器官的比較研究表明,通過(guò)呼吸道引入的PM2.5可通過(guò)血液暴露在呼吸系統(tǒng)以外的二級(jí)器官中引起炎癥。使用雙光子顯微鏡,每個(gè)器官的特定結(jié)構(gòu),包括肺(肺泡和毛細(xì)血管)和肝臟的內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu),以及小鼠模型中中性粒細(xì)胞的形態(tài),都以延時(shí)方式成功監(jiān)測(cè)。這是一種將活體動(dòng)物的肺或肝臟外化以進(jìn)行活體成像的侵入性手術(shù)。手術(shù)過(guò)程可能會(huì)引起外化器官組織的炎癥環(huán)境。因此,最大限度地減少器官組織中的自主炎癥狀況非常重要。

  為了研究施加PM2.5對(duì)小鼠的炎癥作用,我們?cè)趪?yán)格控制的條件下以最小的自主炎癥進(jìn)行手術(shù)。我們還使用H&E染色進(jìn)行了組織學(xué)分析,并使用TEM和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行了超微結(jié)構(gòu)分析。在H&E染色和TEM成像中,我們能夠觀察到經(jīng)過(guò)PM2.5處理后的肺和肝組織中的白細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示,PM2.5處理后48小時(shí)內(nèi),肺中中性粒細(xì)胞顯著增加。盡管該結(jié)果與檢測(cè)組織和血管中免疫細(xì)胞的雙光子活體成像數(shù)據(jù)不一致,但這仍然表明浸潤(rùn)到組織的中性粒細(xì)胞有所增加。

  IL-17 通路的表達(dá)在微陣列,特別是肺組織的富集圖中發(fā)生了變化,PM2.5 處理后 48小時(shí)IL-17 表達(dá)的變化比處理24小時(shí)的更顯著。當(dāng)肺受損時(shí),肺先天淋巴細(xì)胞 (ILC) 會(huì)迅速產(chǎn)生 IL-17,這可以解釋我們的結(jié)果,因?yàn)镮LC對(duì)增強(qiáng)早期免疫病理學(xué)有很大貢獻(xiàn) [14]。PM2.5處理后肝臟代謝相關(guān)通路的表達(dá)發(fā)生變化;更具體地說(shuō),觀察到與代謝相關(guān)的肝功能增強(qiáng)[15]。由于肝臟有 500 多種不同的作用和功能,因此無(wú)法辨別 PM2.5直接影響哪種機(jī)制。與免疫系統(tǒng)直接相關(guān)的反應(yīng)途徑?jīng)]有發(fā)生顯著變化。

  然而,在GSEA中,我們可以發(fā)現(xiàn)與免疫反應(yīng)有關(guān)的CCL5 基因表達(dá)增加。我們的數(shù)據(jù)顯示中性粒細(xì)胞數(shù)量沒(méi)有顯著變化,盡管已知這些先天免疫細(xì)胞會(huì)滲透到炎癥組織中。這可能是因?yàn)槲覀冊(cè)诒緦?shí)驗(yàn)中使用的PM2.5與實(shí)際大氣條件下的PM2.5不同。大氣中的PM2.5主要由碳骨架組成,另外還混有SO42- 、NO 3- 、NH 4 + 離子、有機(jī)物、地殼物質(zhì)等多種物質(zhì)[27]。然而,我們實(shí)驗(yàn)中使用的PM2.5完全由具有簡(jiǎn)單碳骨架的柴油顆粒材料組成。大多數(shù) PM2.5 研究側(cè)重于通過(guò)長(zhǎng)期吸入引起的慢性疾病 [28-31]。在這里,我們對(duì)經(jīng)過(guò)PM2.5處理后48小時(shí)內(nèi)的急性炎癥反應(yīng)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),這可能很難誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞滲透。然而,據(jù)我們所知,這項(xiàng)研究將是第一次嘗試使用活體成像研究每個(gè)免疫細(xì)胞群的遷移模式,并驗(yàn)證PM2.5處理過(guò)的小鼠肺和肝臟中不同的炎癥信號(hào)通路。通過(guò)微陣列數(shù)據(jù)識(shí)別肺和肝組織中的不同通路,表明不同的治療方法可能適用于患有與PM2.5相關(guān)的疾病的患者,具體取決于他們的癥狀。對(duì)PM2.5長(zhǎng)期暴露的進(jìn)一步研究也可能提供與長(zhǎng)期炎癥相關(guān)的各種通路的信息。

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  圖 4:PM2.5 處理后肺和肝臟 mRNA 表達(dá)模式的比較。(a, b) 分別比較肺和肝臟的 PM2.5 治療組和對(duì)照組的微陣列簇圖像。(c, d) 顯示了每個(gè)器官在 PM2.5 處理后 mRNA 表達(dá)增加的 20 個(gè)最重要的京都百科全書基因和基因組 (KEGG) 途徑。紅框顯示了與免疫系統(tǒng)、細(xì)胞因子和人類疾病相關(guān)的通路。(e, f) 顯示了 IFN-γ 反應(yīng)途徑的 GSEA 結(jié)果;PM2.5 處理后 48 小時(shí)評(píng)估的小鼠肺和肝臟中的共同通路顯著增加,NES 分別為 1.792 和 1.434。(g)CCL5基因表達(dá)的定量實(shí)時(shí)PCR分析(2ΔΔCt法)顯示在對(duì)照組和肺和肝臟的PM2.5后48小時(shí)治療組。數(shù)據(jù)表示為平均 SEM (n = 5)。

  該實(shí)驗(yàn)圖像(1)由ivim小動(dòng)物活體原位細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析成像系統(tǒng)完成成像

  (產(chǎn)品資料請(qǐng)參考下文)

  小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)

  活體成像技術(shù)主要是利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器,能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。通過(guò)這個(gè)系統(tǒng),可以觀測(cè)活體動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移,感染性疾病發(fā)展過(guò)程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過(guò)程。其優(yōu)點(diǎn)為較傳統(tǒng)屠宰動(dòng)物相比,該技術(shù)能夠?qū)ν环N實(shí)驗(yàn)對(duì)象在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行記錄,跟蹤同一觀察目標(biāo)(標(biāo)記細(xì)胞及基因)的移動(dòng)及變化,所得的數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。目前主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)兩種技術(shù)。IVM-CM是韓國(guó)IVIM Technology公司全新推出應(yīng)用于小動(dòng)物活體原位動(dòng)態(tài)成像系統(tǒng),能夠?qū)崿F(xiàn)動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)成像活體內(nèi)各種細(xì)胞水平的動(dòng)態(tài)變化,如:上升運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞一細(xì)胞/細(xì)胞微環(huán)境相互作用和對(duì)刺激的各種生理反應(yīng),體內(nèi)成像:肝臟,淋巴結(jié),脾臟,皮膚,視網(wǎng)膜,肺,腦,結(jié)腸,胰腺,小腸,前列腺,腎臟,心臟,氣管,食道,食道,骨髓,胸腺等。

  VM-CM 技術(shù)特點(diǎn):

  √ 雙光子激光器波長(zhǎng)范圍:690nm-1050nm

  √ 視野范圍(FOV):100*100um2-10*10mm2

  √ 成像像素:100fps@512*512pixels

  √成像深度:1000um

  √體內(nèi)成像種類:肝臟,淋巴結(jié),脾臟,皮膚,視網(wǎng)膜,肺,腦,結(jié)腸,胰腺,小腸,前列腺,腎臟,心臟,氣管,食道,食道,骨髓,胸腺等。

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  目前該產(chǎn)品IVM-CM正在和國(guó)內(nèi)知名的WAD集團(tuán),上海埃飛電子科技有限公司合作,為國(guó)內(nèi)科研機(jī)構(gòu)提供快速有效的活體成像解決方案。

  技術(shù)原理:


  應(yīng)用領(lǐng)域:

  免疫學(xué)研究

  癌癥研究

  靶向研究

  分子病理學(xué)

  應(yīng)用案例:

  對(duì)心肌梗死的小鼠心臟中免疫細(xì)胞的延時(shí)成象的新方法:

  IVM-CM通過(guò)特定的窺鏡結(jié)合一個(gè)通過(guò)肋間間隙的小切口來(lái)顯示心臟組織中熒光標(biāo)記的細(xì)胞和血管。提出了一個(gè)微型吸引輔助內(nèi)窺鏡適合成像細(xì)胞事件在跳動(dòng)的心臟的老鼠。內(nèi)窺鏡使用了一個(gè)吸引管裝置,可以局部穩(wěn)定下面的組織而不造成有害影響,并允許細(xì)胞水平成像。內(nèi)窺鏡可以通過(guò)在皮膚和肋骨間的肌間做一個(gè)小切口進(jìn)入心臟的外表面而不折斷骨頭。

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